| Главная » Файлы » Диссертации » Диссертации |
РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН Rhodococcus erythropolis ЕК-1 З ВИКОРИСТАННЯМ ПРОМИСЛОВИХ ВІДХОДІВ
| [ Скачать с сервера (2.91 Mb) ] | 11.08.2017, 13:01 |
| Вступ……………………………………………………………………………. 5 РОЗДІЛ 1 Біосинтез поверхнево-активних речовин на промислових відходах………………………………………………………………………..... 11 1.1 Відходи нафтопереробної галузі як субстрати для синтезу ПАР………. 1.2 Використання олієвмісних субстратів для синтезу мікробних ПАР…... 1.3 Трансформація відходів молочної та цукрової промисловості у ПАР мікробного походження………………………………………………….. 1.4 Утворення мікробних поверхнево-активних речовин на лігноцелюлозних відходах…………………………………………………. 1.5 Синтез ПАР мікробного походження на крохмалевмісній сировині…... 1.6 Біосинтез ПАР на гліцерині – побічному продукті виробництва біодизелю………………………………………………………………………... 12 13 23 27 29 31 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА РОЗДІЛ 2 Матеріали і методи досліджень………………………………… 34 2.1 Об’єкти досліджень……………………………………………………….. 2.2 Культивування R. erythropolis ЕК-1………………………………………. 2.3 Визначення параметрів росту і синтезу поверхнево-активних речовин………………………………………………………………………….. 2.4 Визначення антимікробних властивостей препаратів ПАР…………….. 2.5 Визначення антиадгезивних властивостей препаратів ПАР……………. 2.6 Дослідження біодеструкції нафти ………………………………………... 2.7 Дослідження захисних властивостей поверхнево-активних речовин R. erythropolis ЕК-1.…………............................................................... 2.8 Визначення активності алкангідроксилази………………………………. 2.9 Статистична обробка експериментальних результатів …………………. 34 36 37 39 41 42 45 46 47 РОЗДІЛ 3 Альтернативні джерела вуглецю для синтезу поверхнево-активних речовин R. erythropolis EK-1……………………………………... 50 3.1 Синтез поверхнево-активних речовин за умов росту R. erythropolis ЕК-1 на промислових відходах……………………………….. 3.2 Інтенсифікація біосинтезу поверхнево-активних речовин R. erythropolis EK-1 на олієвмісних субстратах………………………………. 50 56 РОЗДІЛ 4 Вплив катіонів металів на ріст і синтез поверхнево-активних речовин Rhodococcus erythropolis ЕК-1…………………………. 66 4.1 Синтез поверхнево-активних речовин Rhodococcus erythropolis ЕК-1 за внесення Сu2+ у середовище культивування………………………………….. 4.2 Синтез поверхнево-активних речовин штамом ЕК-1 за присутності катіонів кадмію та свинцю…………………………………………………….. 4.3 Вплив Сu2+ на активність алкангідроксилази Rhodococcus erythropolis ЕК-1……………………………………………………………………………… 4.4 Дослідження захисних функцій поверхнево-активних речовин у присутності Сu2+………………………………………………………………... 4.5 Технологічна схема біосинтезу ПАР R. erythropolis ЕК-1 на пересмаженій соняшниковій олії……………………………………………… 66 71 74 76 77 РОЗДІЛ 5 Поверхнево-активні речовини R. erythropolis EK-1 як антимікробні та антиадгезивні агенти……………………………………... 83 5.1 Дія поверхнево-активних речовин на деякі мікроорганізми……………. 5.2 Антиадгезивні властивості препаратів поверхнево-активних речовин………………………………………………… 5.3 Поверхнево-активні речовини як препарати для контролю чисельності фітопатогенних бактерій………………………………………… 83 87 90 РОЗДІЛ 6 Використання клітин Rhodococcus erythropolis EK-1 та їх метаболітів для деструкції нафтових забруднень………………………… 95 6.1 Біодеструкція нафти у ґрунті за присутності поверхнево-активних речовин R. erythropolis ЕК-1…………………………………………………… 6.2 Нафтовідмиваючі властивості поверхнево-активних речовин R. erythropolis ЕК-1……………………………………………………………... 6.3 Деструкція комплексних з важкими металами нафтових забруднень у воді і ґрунті препаратами ПАР R. erythropolis ЕК-1…………………………. 6.4 Очищення ґрунту і води від нафти препаратами поверхнево-активних речовин Rhodococcus erythropolis ЕК-1 за наявності Cu2+, Cd2+ і Pb2+……... 6.5 Порівняльна характеристика препаратів ПАР штаму ЕК-1 з комерційним аналогами, використовуваними для очищення довкілля від нафти……………………………………………………………………………. 95 98 99 104 109 РОЗДІЛ 7 Обговорення……………………………………………………… Висновки……………………………………………………………………….. Список використаних джерел ………………………………………………. Додаток А………………………………………………………………………. Додаток Б………………………………………………………………………. 112 126 128 157 159 ВСТУП Актуальність роботи. Унікальні особливості мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР) зумовлюють їх використання у різноманітних галузях промисловості замість хімічно-синтезованих аналогів [199]. ПАР мікробного походження знаходять застосування для вирішення ряду практичних завдань, що гостро постали перед людством: усунення екологічних проблем (забруднення ґрунтів і водойм токсичними ксенобіотиками, що загрожує екологічною катастрофою), пошук альтернативних антимікробних препаратів проти резистентних мікроорганізмів, а також фітопатогенних бактерій [52, 80, 89, 145, 149, 157, 202, 226, 227]. Але раціональне використання ПАР мікробного походження залежить в першу чергу від економічної ефективності їх виробництва. Одним із способів здешевлення технології мікробних ПАР є використання дешевих ростових субстратів, наприклад, відходів інших виробництв [47, 162, 113, 163, 198]. Раніше на кафедрі біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій із забруднених нафтою зразків ґрунту було виділено штам нафтоокиснювальних бактерій, ідентифікований як Rhodococcus erythropolis ЕК-1 [18] і депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології за номером ІМВ Ac-5017. Встановлено здатність штаму ЕК-1 до синтезу ПАР на н-гексадекані та етанолі, оптимізовано склад поживного середовища та умови культивування продуцента [18]. Визначено фізіологічні основи регуляції синтезу ПАР у процесі вирощування R. erythropolis ЕК-1 на гідрофільних і гідрофобних сполуках [178] і масштабовано технологію на ферментаційному обладнанні [179]. Заміна традиційних субстратів для біосинтезу ПАР, у тому числі й синтезованих R. erythropolis ЕК-1, відходами промислових виробництв (оліє-жирової промисловості, використаної соняшникової олії, гліцерину, меляси, рідких парафінів) дасть змогу здешевити собівартість технології у кілька разів, а також утилізувати непотрібні відходи, зняти з підприємств харчової промисловості, сільськогосподарського сектору та підприємств, що виробляють біодизель проблему зберігання або знешкодження значної маси відходів, на що витрачається велика кількість енергії та коштів. Крім того, літературні дані стосовно здатності представників роду Rhodococcus до синтезу ПАР на відходах є вкрай обмеженими. Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно плану науково-дослідних робіт кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій за темою «Розробка високоефективних ресурсозберігаючих біотехнологій з метою їх впровадження у мікробіологічну, фармацевтичну та харчову промисловість» (2006–2010, 2011–2015 рр.), а також у рамках фундаментального дослідження за рахунок видатків загального фонду державного бюджету «Розробка наукових основ регуляції синтезу і фізико-хімічних властивостей мікробних сурфактантів мультифункціонального призначення» (2010–2012 рр.), № державної реєстрації 0109U008586. Мета і задачі дослідження. Мета роботи – розробити технологію поверхнево-активних речовин R. erythropolis ЕК-1 з використанням промислових відходів як субстратів та дослідити можливості їх практичного використання. Для виконання роботи потрібно було вирішити такі завдання: дослідити здатність до синтезу ПАР під час культивування R. erythropolis ЕК-1 на деяких промислових відходах; дослідити вплив екзогенних попередників на синтез ПАР за умов росту R. erythropolis ЕК-1 на відходах виробництв; дослідити вплив катіонів важких металів на ріст штаму ЕК-1 і синтез ПАР, а також захисні функції поверхнево-активних речовин; дослідити ефективність деструкції нафтових забруднень у воді та ґрунті за присутності препаратів ПАР R. erythropolis ЕК-1; визначити антимікробні та антиадгезивні властивості ПАР штаму ЕК-1; розробити технологічну схему біосинтезу ПАР R. erythropolis ЕК-1 на промислових відходах. Об’єкт дослідження – R. erythropolis ЕК-1 та мікробні поверхнево-активні речовини. Предмет дослідження – біосинтез поверхнево-активних речовин мікробного походження, очищення води і ґрунту від нафтових забруднень, антимікробна та антиадгезивна дія ПАР. Методи дослідження. Під час виконання дисертаційної роботи використовували такі методи досліджень: мікробіологічні (визначення морфолого-культуральних ознак бактерій, антимікробних та антиадгезивних властивостей, захисних властивостей ПАР, кількості життєздатних мікробних клітин); біотехнологічні (культивування мікроорганізмів, дослідження ефективності біодеструкції нафти); фізико-хімічні (визначення поверхневого натягу, концентрації ПАР і біомаси, індексу емульгування, рН, концентрації нафти у воді, ґрунті та піску); біохімічні (визначення активності алкангідроксилази); математичні (статистична обробка результатів досліджень). Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено можливість заміни високовартісних субстратів (н-гексадекан та етанол) для біосинтезу ПАР R. erythropolis ЕК-1 на промислові відходи (оліє-жирової промисловості, пересмажену соняшникову олію, гліцерин, рідкі парафіни). Найвищі показники синтезу ПАР спостерігалися на олієвмісних субстратах і перевищували такі на н-гексадекані і етанолі у 1,3–3 рази. Показано, що найбільша кількість ПАР утворювалась на пересмаженій олії за використання інокуляту, вирощеного на мелясі. Встановлено можливість інтенсифікації у 3–4 рази синтезу ПАР R. erythropolis ЕК-1 на пересмаженій соняшниковій олії внесенням у середовище екзогенних попередників поверхнево-активних гліколіпідів (глюкоза або меляса у концентрації 0,1 % за вуглеводами). Показано стимуляцію синтезу ПАР штамом ЕК-1 за внесення у середовище з гідрофільними (етанол) та гідрофобними (н-гексадекані, рідкі парафіни, пересмажена соняшникова олія) субстратами катіонів міді (0,01–0,1 мМ) у середині експоненційної фази росту. Інтенсифікація синтезу ПАР на вуглеводнях за наявності Cu2+ зумовлена активацією алкангідроксилази R. erythropolis ЕК-1. Встановлено, що інтенсифікація деструкції комплексних з важкими металами нафтових забруднень за присутності ПАР R. erythropolis ЕК-1 зумовлена як активацією природної нафтоокиснювальної мікрофлори, так і захисними функціями ПАР щодо дії токсичних металів. Практичне значення одержаних результатів. Розроблено технологію біосинтезу ПАР R. erythropolis ЕК-1 на олієвмісних відходах, яка включає: 1) використання як джерела вуглецю пересмаженої соняшникової олії (2,0 %, об’ємна частка); 2) використання посівного матеріалу, вирощеного на мелясі; 3) внесення у середовище на початку культивування 0,1 % (масова частка) глюкози та 0,1 мМ Сu2+ у середині експоненційної фази росту. Реалізація даної технології дала змогу підвищити концентрацію позаклітинних ПАР у 4–4,5 рази порівняно із розробленими раніше на основі н-гексадекану та етанолу. Встановлено антимікробну дію ПАР R. erythropolis ЕК-1 на деякі мікроорганізми, у тому числі й фітопатогенні бактерії. Показано, що за обробки поверхонь зубних протезів препаратами ПАР штаму ЕК-1 ступінь адгезії бактеріальних і дріжджових клітин знижувався на 45–65 % порівняно із необробленими матеріалами. Показано можливість застосування низьких концентрацій препаратів ПАР R. erythropolis ЕК-1 у вигляді постферментаційної культуральної рідини для ефективної деструкції (86–95  нафтових забруднень у воді (2,6 г/дм3) та ґрунті (20 см3/кг), у тому числі й за присутності катіонів важких металів. Встановлено, що препарати ПАР забезпечують на 30–35 % вищий ступінь деструкції нафти, ніж комерційний препарат «Деворойл». Прогнозований коефіцієнт ефективності капіталовкладень для очищення довкілля від нафти з використанням препаратів ПАР R. erythropolis ЕК-1 перевищує нормативний коефіцієнт для природоохоронних заходів у 4 рази, що свідчить про високу ефективність запропонованої біотехнології. Технологія синтезу ПАР на пересмаженій олії захищена патентом України на корисну модель (№ 63962, опубл. 25.10.2011, бюл. № 20), а також патентом України на винахід (№ 98571, опубл. 25.05.2012, бюл. № 10). Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, проаналізовано наукову літературу з даної проблеми, узагальнено отримані експериментальні дані, проведено порівняльний аналіз з існуючими літературними даними. Планування основних напрямів і результатів роботи, підготовка публікацій за результатами досліджень проходило за безпосередньої участі наукового керівника д-ра біол. наук, проф. Т.П. Пирог. Визначення активності ферментів здійснювали спільно з інженером відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ Шевчук Т.А., а дослідження антимікробних властивостей ПАР – з асистентом кафедри біотехнології і мікробіології НУХТ Конон А.Д., які є співавторами публікацій. Софілканич А.П. є лауреатом Третьої премії конкурсу на кращу наукову роботу на тему «Зробимо Україну енергоощадною», проведеного Інститутом стратегічних оцінок при Президентському фонді Леоніда Кучми (2010 р.). Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на Міжнародній науково-практичній конференції «Регионы в условиях неустойчивого развития» (м. Шарья, Російська Федерація, 2010), Міжнародній науковій конференції «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (м. Мінськ, Республіка Білорусь, 2010), I Міжнародній науково-практичній конференції «Актуальные вопросы науки» (м. Москва, Російська Федерація, 2011), Міжнародній науково-технічній конференції «Инновационные технологии переработки продовольственного сырья» (м. Владивосток, Російська Федерація, 2011), Всеросійській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Биологический мониторинг природно-техногенных систем» (м. Кіров, Російська Федерація, 2011), Міжнародній науково-практичній конференції «Формування, охорона та захист здоров’я в сучасних умовах (м. Одеса, 2012), Міжнародній науково-практичній конференції “Rozwoj nauk humanistycznych” (м. Познань, Польща, 2012), I Міжнародній Інтернет-конференції «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (м. Казань, Російська Федерація, 2012), Міжнародній науково-практичній Інтернет-конференції «Розвиток країн в умовах глобалізації: технологічні, економічні, соціальні та екологічні проблеми» (м. Тернопіль, 2012), ІІ Міжнародній науковій конференції «Современная биология: вопросы и ответы» (м. Санкт-Петербург, Російська Федерація, 2012), VIII Міжнародній науково-практичній конференції «DNY VĚDY – 2012» (м. Прага, Чеська Республіка, 2012), Міжнародній науково-практичній конференції «Современные проблемы географии, экологии и природопользования» (м. Волгоград, Російська Федерація, 2012), VI Міжнародній конференції «Еcological and hydrometeorological problems of the large cities and industrial areas» (м. Санкт-Петербург, Російська Федерація, 2012), ІІ Міжнародній заочній науково-практичній конференції «Современная научная мисль: проблемы и перспективы развития» (м. Чебоксари, Російська Федерація, 2012), ІІ Міжнародній науково-технічній конференції «Актуальные проблемы освоения биологических ресурсов мирового океана» (м. Владивосток, Російська Федерація, 2012), Міжнародній заочній науково-практичній конференції «Urgent problems of natural sciences» (м. Тамбов, Російська Федерація, 2012), Міжнародній науково-технічній конференції «Наука и образование – 2012» (м. Мурманськ, Російська Федерація, 2012). Публікації. За результатами наукових досліджень опубліковано 65 наукових праць, із них 8 статей, з яких 6 − у фахових виданнях, 1 − у журналі бази SCOPUS, та 57 тез доповідей, 1 патент України на винахід, 1 патент України на корисну модель. Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 166 сторінках машинописного тексту і складається з таких структурних частин: «Вступ», «Огляд літератури» (1 розділ), «Результати досліджень» (5 розділів), «Обговорення», «Висновки», «Список використаних джерел», який містить 251 посилання (з них 213 іноземних авторів). Робота містить 35 таблиць та 5 рисунків. РОЗДІЛ 1 БІОСИНТЕЗ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН НА ПРОМИСЛОВИХ ВІДХОДАХ На даний час у світі спостерігається підвищений інтерес до застосування мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР) у різних галузях промисловості, що зумовлено їхньою екологічною безпечністю та високою ефективністю [145, 157, 199]. Проте не зважаючи на очевидні переваги мікробних ПАР над синтетичними аналогами існують проблеми, пов’язані із впровадженням їх промислового виробництва. У зв’язку з цим дослідження останнього десятиліття фокусуються на вивчені шляхів здешевлення технологій мікробних ПАР [163, 198]. Згідно із Syldatk та співавт. [226] факторами, які лімітують використання ПАР мікробного походження у промислових масштабах, є висока вартість субстратів для їхнього синтезу, невисокий вихід продукту, а також утворення суміші сполук, а не однієї чистої поверхнево-активної речовини. Дані фактори, а також інші тонкощі біотехнологічного виробництва ПАР (наприклад, необхідність додавання піногасника, вартісне обладнання тощо) зумовлюють високу вартість кінцевого продукту. Визначено, що для здешевлення технологій мікробних ПАР необхідно: 1) детальне вивчення метаболізму та шляхів синтезу ПАР конкретним мікроорганізмом продуцентом, на основі чого здійснюється оптимізація складу поживного середовища та пропонується використання дешевих субстратів (відходів інших виробництв); 2) підвищення ефективності біосинтезу за рахунок оптимізації умов культивування продуцента, вибору економічно вигідного способу виділення та очищення продукту; 3) збільшення виходу ПАР за рахунок використання високопродуктивних мутантних штамів мікроорганізмів [141, 222, 243]. Використання агропромислових відходів є найбільш привабливим способом здешевлення технологій мікробних ПАР, адже рослинна біомаса є доступною поновлюваною сировиною, яка містить необхідні для росту мікроорганізмів поживні речовини [141, 169, 198]. Також перспективними субстратами для синтезу ПАР є відходи інших галузей промисловості, таких як харчова чи нафтопереробна [140, 193, 248]. Крім цього такий підхід матиме позитивний екологічний ефект, оскільки дасть змогу утилізувати відходи, які у значних кількостях потрапляють у навколишнє середовище [141, 170, 198]. 1.1 Відходи нафтопереробної галузі як субстрати для синтезу ПАР Відходи нафтопереробної галузі є найбільш наближеними за хімічним складом до н-гексадекану, який є традиційним субстратом для біосинтезу ПАР. Також варто зазначити, що дані відходи є найбільш екологічно небезпечними і питання щодо їх утилізації стоїть досить гостро. До таких відходів відноситься, наприклад, моторне мастило. У роботі [58] наводиться приклад використання відпрацьованого моторного мастила (2 %, об’ємна частка) як субстрату для синтезу ПАР Corynebacterium kutscheri sp. у ферментаційному обладнані (3 дм3). Максимальна концентрація ПАР була зафіксована на 132 год культивування і становила 6,4 г/см3. Встановлено, що досліджуваний штам синтезував ПАР гліколіпопептидної природи, що складалися на 40 % з вуглеводів, на 27 % з ліпідів і на 29 % з протеїнів [58]. Відомо, що недоліком використання відходів нафтопереробної галузі як субстратів для біосинтезу є наявність у їхньому складі токсичних речовин (фенолу та його похідних), які можуть пригнічувати ріст культур-продуцентів [26]. Було досліджено антимікробну дію мінеральних моторних олив (ММО) на ряд штамів Rhodococcus еrythropolis: УКМ Ас-31, УКМ Ас-43, УКМ Ас-44, У KM Ас-48, УКМ Ас-50, УКМ Ас-58, УКМ Ас-73 та УКМ Ас-77 [34]. Показано, що всі без винятку штами були чутливими до концентрації фенолу 0,06 г/см3 та стійкими до 0,005 г/см3. Встановлено, що найбільша чутливість до даної сполуки була притаманна штамам УКМ Ас-31, УКМ Ас-44 та УКМ Ас-50 (відсутність росту за додавання 0,01 г/см3 фенолу), стійкішими виявилися штами УКМ Ас-43, УКМ Ас-48, УКМ Ас-58 та УКМ Ас-73, а найбільш резистентним – штам УКМ Ас-77 (витримував концентрацію фенолу 0,05 г/см3) [34]. Слід зауважити, що сьогодні відома велика кількість мікроорганізмів здатних асимілювати фенол, а також витримувати його високі концентрації. Особливо активними деструкторами є бактерії роду Acinetobacter і Pseudomonas. Штами Acinetobacter sp. PD12, Pseudomonas sp. PD39 та ін. утилізували фенол за концентрації 1100 мг/дм3. Ефективність очищення стічних вод, що містили 800 мг/дм3 фенолу, бактеріями штаму PD39 становила 99,96 % через 72 год [50, 71, 94, 125]. Зважаючи на переваги використання іммобілізованих клітин, штам PD12 було закріплено на гелевій матриці. При цьому клітини зберігали свою метаболічну активність. Дослідження показали що штам PD12 утилізував фенол (500 мг/дм3) на 99,6 % протягом 9 год [50]. Здатність до асиміляції фенолу притаманна не тільки бактеріям, а й дріжджам C. tropicalis sp. [122]. Так, даний штам досить легко утилізував фенол за концентрації 500 мг/дм3, тривалість процесу збільшувалася за концентрації 1000 мг/дм3, а за 1500−2000 мг/дм3 ріст дріжджів припинявся. Слід зазначити, що у процесі досліджень також було виявлено здатність C. tropicalis sp. до синтезу поверхнево-активних речовин [122]. У роботі [77] показано здатність Bacillus mojavensis XH1 синтезувати біоемульгатор (2,07 г/дм3) за умов культивування у поживному середовищі, що містило як субстрати 3 % рідких парафінів та 8,5 % глюкози, а також 1,5 % дріжджового екстракту, 3,36 г/дм3 амонію хлориду, 15 г/дм3 фосфатів. Незважаючи на те, що відходи нафтопереробної галузі за хімічним складом є найбільш наближеними до традиційних субстратів для синтезу ПАР, їх вартість є порівняно високою, а наявність у їхньому складі побічних домішок негативно впливає на більшість продуцентів. | |
| Просмотров: 465 | Загрузок: 24 | Рейтинг: 0.0/0 | |
| Всего комментариев: 0 | |