| Главная » Файлы » Лабораторные работы » Лабораторные работы |
Кількісне визначення глюкози за допомогою глюкозооксидази
| [ Скачать с сервера (86.2 Kb) ] | 05.08.2017, 23:13 |
| Кількісне визначення глюкози за допомогою глюкозооксидази Метод базується на каталітичній дії ферменту глюкозооксидази (ГO) на процес окиснення глюкози киснем повітря до глюконової кислоти за реакцією: Рис.1. Окиснення глюкози киснем у присутності ферменту глюкозооксидази. Активний центр ГО містить залишки 3-х амінокислот : His516, Glu412, який зв’язаний водневим зв’язком з His559. Ко-фактором ферменту виступає молекула ФАД (флавінаденіндинуклеотид), яка діє як електрон-акцептор, відновлюючись потім до ФАДН2; молекула ФАДН2 окиснюється далі молекулярним киснем до молекули ФАД та Н2О2 (http://www.ebi.ac.uk/interpro/potm/2006_5/Page1.htm). Утворений в еквімолярному співвідношенні пероксид водню під дією іншого ферменту – пероксидази (гемоглобін), розкладається і окиснює бромпірогалоловий червоний (БПЧ), що вводиться у реакційну суміш. При цьому спостерігається зменшення інтенсивності забарвлення БПЧ та утворення продуктів жовтого кольору, зменшення інтенсивності забарвлення БПЧ пропорційна концентрації глюкози в реакційній суміші. Рис.2. Рівняння електрокаталітичного окиснення БПЧ в системі Со2+ - Н2О2 (Junshui Chen & oth.. Electrochemical degradation of bromopyrogallol red in presence of cobalt ions.- Chemosphere 53 (2003) 1131–1136) Розчини, реактиви, обладнання: стандартний розчин глюкози (0,01М); фосфатний буфер, рН 6,8; розчин глюкозооксидази, 5,0*10-5 М (7,5 мг білку розчиняють у 1,0 мл води); свіжеприготований препарат пероксидази 6,6*10-4М, (розчин гемоглобіну, зважують на аналітичних терезах 43 мг гемоглобіну і розчиняють наважку в 1,0 мл води; розчин зберігають у холодильнику); розчин БПЧ, 1*10-4М; розчин трилону Б - 0,001 М, бідистильована вода, зразок соку (виноградно-яблучний нектар освітлений пастеризований «Наш сік». Склад: натуральні соки концентровані виноградний з білих сортів, яблучний, цукровий сироп, глюкозно-фруктозний сироп, регулятор кислотності – лимонна кислота, натуральні ароматизатори винограду та яблука. Поживна цінність на 100 г продукту: вуглеводи – 11,1 г, білки – 0,2 г, жири – 0 г.). Скляні палички, пробірки, піпетки, штатив для пробірок, кювети на 1,0 см, КФК 2МП. Хід роботи. Для побудови градуювального графіку у 6 пробірок додають по 0,5 мл фосфатного буферу, рН 6,8, по 0,5 мл розчину трилону Б і відповідні аліквоти стандартного розчину глюкози, з таким розрахунком, щоб концентрація глюкози в кінцевому об’ємі (10 мл) становила: 1,0; 2,0; 5,0; 8,0* 1*10-4 та 1*10-3 М. Далі до розчинів додають бідистилят до загального об’єму 10 мл і по 20 мкл розчину глюкозооксидази. Суміш перемішують і витримують на водяній бані протягом 10 хв. при температурі 30-35оС. Потім до кожної пробірки додають 1,0 мл розчину БПЧ та по 20 мкл розчину препарату пероксидази, суміш перемішують та витримують на водяній бані ще 10 хв. Після цього розчини переносять у кювету ℓ =1,0 см і вимірюють їх оптичну густину на КФК при =540 нм відносно води. Також вимірюють сигнал холостого розчину, який містить всі компоненти, крім глюкози та глюкозооксидази. За отриманими даними будують градуювальний графік у координатах: А540 – концентрація глюкози, М. Концентрацію глюкози в невідомому розчині визначають за градуювальним графіком. Пробу соку розбавляють в 100 раз та відбирають 0,5 та 1,0 мл розбавленого розчину, що відповідає Пробі 1 та Пробі 2. Таблиця 1. Умови спектрофотометричного визначення концентрації глюкози. С(трилон Б)=5*10-5 М, рН 6,8; С(ГО)=1*10-10 М; С(БПЧ)=1*10-5 М; С(пероксидаза)=1,32*10-9 М. № С(глюкози), моль/л Val(глюкози), мл А540, відн.од. Холостий - - 0,341 1 1*10-4 0,1 0,248 2 2*10-4 0,2 0,115 3 5*10-4 0,5 0,047 4 8*10-4 0,8 0,051 5 1*10-3 1,0 0,052 Проба 1 - 0,197 Проба 2 - 0,057 Рис.3. Градуювальник графік визначення глюкози за зменшенням інтенсивності забарвлення БПЧ під дією ферментів. А540=(0,35±0,01)+(-0,11±0,01)*C(глюкози)*10-4, М. R2=0,9793. С(трилон Б)=5*10-5 М; рН 6,8; С(ГО)=1*10-10 М; С(БПЧ)=1*10-5 М; С(пероксидаза)=1,32*10-9 М, Vзаг=11,0 мл. | |
| Просмотров: 506 | Загрузок: 12 | Рейтинг: 0.0/0 | |
| Всего комментариев: 0 | |