| Главная » Файлы » Лабораторные работы » Лабораторные работы |
Визначення кофеїну в напоях та цукерках методом рідинної хроматографії на оберненій фазі
| [ Скачать с сервера (46.1 Kb) ] | 13.06.2017, 23:58 |
| Кофеїн – азотовмісна органічна слабка основа (К = 4.1 ∙10-14), належить до класу алкалоїдів. Кофеїн (або кофеїн моногідрат) містить не менше 98,5 % і не більше 101,5 % 1,3,7-триметил-3,7-дигідро,-1H-пурин-2,6-діону, у перерахунку на суху речовину. Опис. Кристалічний порошок або шовковисті кристали білого кольору, легко сублімуються, гіркуваті на смак, дуже мало розчинні в холодній воді, добре розчинні в гарячій воді, мало розчинні в спирті, ефірі і хлороформі. М(C8H10N4O2) = 194.19 г/моль, М(C8H10N4O2∙Н2О) = 212.21 г/моль. Вміст кофеїну в безалкогольних напоях варіюється в широких межах: від 100 мкг/мл (100 ppm) в газованих водах до 1000 мкг/мл в певних сортах кави. Стакан чаю містить 0.05 – 0,1 г кофеїну. Кофеїн швидко всмоктується в кишках. Його дія настає через 20-30 хв. після прийому всередину і через 5 – 8 хв. після підшкірного введення. Він є стимулятором центральної нервової системи. В медичній практиці кофеїн застосовують при гострій судинній недостатності, слабкості серцевого м’язу, для зменшення психічного та фізичного болю, особливо при мігрені. Визначення кофеїну в напоях проводять через їх загальнопоширену фальсифікацію. Наприклад, дуже розповсюджене додавання фармацевтичного кофеїну в каву або кавовий сурогат. Фармацевтичний кофеїн додають у каву, як для фальсифікації кави, так і для формування у населення стійкого попиту на каву певної фірми. Спектрофотометрія забезпечує чутливий метод виявлення і визначення кофеїну. В УФ-спектрі поглинання кофеїн має дві смуги з максимумами піків при 205 нм і 275 нм з характериним плечем поглинання між ними. Зазвичай, вміст кофеїну визначають вимірюючи поглинання при 275 нм. Безалкогольні напої містять безліч супутніх речовин. Багато з них поглинають випромінювання при 275 нм. Тому пряме визначення кофеїну в безалкогольних напоях неможливе. Кофеїн треба спочатку відділити/розділити від інших сполук. Розділення кофеїну від інших супутніх речовин легко досягається за допомогою ВЕРХ на неполярній колонці C18 і рухомій фазі ацетонітрил/вода. Порівняння площі піків кофеїну для зразків безалкогольних напоїв з площею піків для стандартів дозволяє кількісно визначати вміст кофеїну. Метод визначення кофеїну ґрунтується на отриманні водних витяжок чаю та кави, екстрактів цукерок, дегазації водних напої, що містять кофеїн з наступним виявленням та визначенням кофеїну методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії з використанням спектрофотометричного детектору, вимірюючи поглинання при довжині хвилі 270 нм. Для якісного виявлення кофеїну використовують час виходу стандартного розчину, для кількісного – метод абсолютного градуювального графіка, що встановлює залежність площі піку від його масової концентрації. Розчинники, реактиви 1. Ацетонітрил для рідинної хроматографії (х.ч., додатково очищений перегонкою над Р2О5). 2. Вода «Міліпор», бідистильована. 3. Стандартний розчин кофеїну (С = 0,2 мг/мл). 4. Ацетатний буферний розчин рН = 4,8. 5. Октадецильний картридж. Прилади, посуд: 1. Рідинний хроматограф "Міліхром-2" з УФ-спектрофотометричним детектором. 2. Мембранні фільтри з розміром пор 0.45 мкм. 3. Мікрошприці. 4. Піпетки ємністю на 1 (1 шт), 5 (2 шт), 10 мл (1). 5. Конічні колби (8 шт.). 6. Мірні колби (25 мл). 7. Іономер «И-106М». 8. Терези аналітичні. 9. Терези лабораторні. Об’єкти дослідження Кава розчинна, кава нерозчинна, чай, «Pepsi», «Cola», цукерки. Приготування розчинів Розчин індивідуальної визначуваної речовини – кофеїну. В колбі на 25 мл наважку кофеїну масою 5 мг розчиняють у воді (С = 0,2 мг/мл). Розбавте вихідний розчин в 2, 4, 10 разів. Відфільтруйте їх через мембранний фільтр з розміром пор 0.45 мкм. Розрахуйте концентрацію кожного стандартного розчину. Елюент. Ацетонітрил : ацетатний буферний розчин у об’ємному співвідношенні 12,5%:87,5%. Приготування ацетатного буферного розчину. Наважку 4,1 г натрію ацетату (CH3COONa∙3H20) вносять в колбу місткістю на 100 мл, розчиняють в бідистиляті, перемішаують до повного розчинення. В цю ж колбу вносять 3,0 г льодяної оцтової кислоти. Доводять водою до мітки, перемішують. Приготування елюенту. В мірний циліндр на 100 мл наливають 12,5 мл ацетонітрилу і 1 мл приготовленого ацетатного буферного розчину, доводять водою до мітки. Елюент профільтровують через мембранний фільтр з розміром пор 0,45 мкм під вакуумом. Елюент придатний для застосування на протязі 7 діб від дня приготування при кімнатній температурі зберігання. Пробопідготовка Визначення кофеїну у розчинній каві і чаї. В 2 конічні колби внести наважку чаю та кави масою m=1 г, 50 мл гарячої бідистильованої води. Розчини охолоджують, кількісно переносять в колби на 250 мл, доводять розчин до мітки бідистильованою водою. Розчини напоїв центрифугують 30´ при 8000 об/хв., фільтрують через мембранний фільтр. Розчин використовують для хроматографії, або проводять процедуру ТФЕ з метою додаткового очищення та концентрування проби. Визначення кофеїну в напоях «Pepsi» або «Cola». В конічну колбу налийте 10-15 мл «Pepsi» або «Cola» і проведіть дегазацію напою перемішуванням розчину на магнітній мішалці. Далі розчини фільтрують через паперовий фільтр з синьою стрічкою, а потім через мембранний фільтр. Визначення кофеїну в цукерках. На лабораторні ваги поміщають суху чисту конічну колбу місткістю 250 мл. Зважуюють її вагу з точністю до 1 мг. В колбу зважують 1 г, попередньо подрібнених шоколадних цукерків (або шоколад). Знімають рівноважку 1 г і ставлять рівноважку 100 г, доливають дистильовану воду до ваги 100 г (точно). Колбу ставлять на електричну плитку або пісчану баню і нагрівають її до кипіння, періодично перемішуючи. Після закипання води, колбу знімають, дають остигнути до кімнатної температури. Колбу знову ставлять на ваги і по краплям добавляють воду до початкової ваги розчину 100 г, перемішують. Відбирають 5 мл екстракту в пробірку на 20 мл, додають 5 мл гексану і струшують 1-2 хв. Після розділення шарів відбирають 1-2 мл нижнього водного шару і фільтрують через фільтр Millipore 0,45 мкм. Фільтрат використовують для хроматографії. Режими роботи приладу «Міліхром-2»: Витрати елюента 80 мкл/хв Об’єм проби 10 мкл Колонка колонка аналітична хроматографічна (Сепарон C18), 64×2 мм Довжина хвилі детектора 270 нм Режим елюювання ізократичний Режим введення проби Автоматичний Хід роботи А. Аналіз градуювальних розчинів Заповніть віали автосамплеру рухомою фазою, градуювальними розчинами у порядку збільшення їх концентрації та досліджуваними зразками. Включіть хроматограф, комп’ютер, відкрийте діалогове вікно програми «ECHROM». В режимі «МЕНЮ» відкрийте директиву «Управління», виберіть «Ручне управління». На моніторі з’являється вікно з параметрами для керування детектором, насосом, дозатором. Запишіть необхідні параметри. Таблиця Ошибка! Текст указанного стиля в документе отсутствует..1. Спектрофотометр на УФ область: Насос: Зупинка після, мкл : 2500 Витрати елюенту, мкл/хв : 200 Швидкість набору, мкл/хв : 800 Карусель: Позиція N : 05 Час вимірювання, с : 00.4 Масштаб, е.о.п. : -1.00 10.00 Число довжин хвиль : 1 Довжини хвиль, нм : 270 Межі спектру, нм : 190 360 Стабілізуйте колонку елюентом, контролюючи стабільність базової лінії на аналітичні довжині хвилі 270 нм протягом 10-15 хв. Для цього послідовно натисніть клавіші: <F7> – Повернути карусель на N позицій. <F6> – Опустити голку. <F4> – перехід в режим «Набор» насосу. <F3> – Запустити насос. Насос вимикається після набраної кількості елюенту вказаної (2500) в Таблиця Ошибка! Текст указанного стиля в документе отсутствует..1. В Таблиця Ошибка! Текст указанного стиля в документе отсутствует..1 змінити позицію каруселі N на 00 <F7> – Повернути карусель на N позицій. <F6> – Опустити голку. <F4> – перехід в режим «Подача» насосу. <F3> – Запустити насос. Насос вимикається після пропускання набраної кількості елюенту (2500) вказаної в Таблиця Ошибка! Текст указанного стиля в документе отсутствует..1. <F5> – Включити детектор в режимі «спектр» (перевірте промивання колонки за кривизною базової лінії). У меню «Параметри» виберіть директорію «Редагування». В першому вікні задайте об’єм (500 мкл) та положення (перше, червоне) віали для елюента. Задайте умови хроматографування градуювальник розчинів та досліджуваних зразків. Об’єм проби 5 мкл. Кількість паралельних аналізів задавайте по 3 для кожного зразка. Послідовність вказуйте починаючи з положення 01 (тричі) – для першого, 02 (тричі) – для другого розчину, 03 (тричі) – для третього градуювального розчину. Об’єми, мкл: градієнта 0500 Час вимірювання, с: 00.4 Ступенів 0500 0000 0000 0000 0000 0000 0000 0000 Масштаб реєстрації: 0.5 04.0 Число довжин хвиль: 1 Довжини хвиль, нм: 270 Межі спектри, нм: 190 360 Об’єми, мкл: регенерації 050 Кількість аналізів: 3 буфера 1: проби: буфера 2: 05 05 05 Послідовність: 01 01 01 Витрати елюенту, мкл/хв 100 Швидкість набору, мкл/хв 900 | |
| Просмотров: 748 | Загрузок: 18 | Рейтинг: 0.0/0 | |
| Всего комментариев: 0 | |