| Главная » Файлы » Мои файлы |
Учбово-дослідна робота ТЕМА: «Визначення впливу pH на амілолітичну активність ферментів»
| [ Скачать с сервера (88.5 Kb) ] | 21.01.2018, 22:36 |
| 1. Вступ Термін фермент запропонований в XVII столітті хіміком ван Гельмонтом при обговоренні механізмів травлення. В кін. ХVIII - поч. XIX ст. вже було відомо, що м'ясо перетравлюється шлунковим соком, а крохмаль перетворюється на цукор під дією слини. Однак механізм цих явищ був невідомий [1] У XIX в. Луї Пастер, вивчаючи перетворення вуглеводів в етиловий спирт під дією дріжджів, дійшов висновку, що цей процес ( бродіння) каталізується якоюсь життєвою силою, що перебуває в дріжджових клітинах. Більше ста років тому терміни фермент і ензим відображали різні точки зору в теоретичному спорі Л. Пастера з одного боку, і М. Бертло і Ю. Лібіха - з іншого, про природу спиртового бродіння. Власне ферментами (від лат. fermentum - Закваска) називали "організовані ферменти" (тобто самі живі мікроорганізми), а термін ензим (від греч. ἐν- - В-і ζύμη - дріжджі, закваска) запропонований в 1876 В. Кюне для "неорганізованих ферментів", секретується клітинами, наприклад, в шлунок ( пепсин) або кишечник ( трипсин, амілаза). Через два роки після смерті Л. Пастера в 1897 Е. Бухнер опублікував роботу "Спиртове бродіння без дріжджових клітин", в якій експериментально показав, що безклітинний дріжджовий сік здійснює спиртове бродіння так само, як і незруйновані дріжджові клітини. В 1907 за цю роботу він був удостоєний Нобелівської премії. Вперше високоочищений кристалічний фермент (уреаза) був виділений в 1926 році Дж. Самнером. Протягом наступних 10 років було виділено ще кілька ферментів, і білкова природа ферментів була остаточно доведена. Каталітична активність РНК вперше була виявлена в 1980-і роки у пре-рРНК Томасом Чеком, що вивчав сплайсинг РНК у інфузорії Tetrahymena thermophila. Рибозимів виявилася ділянка молекули пре-рРНК Tetrahymena, що кодується Інтрон позахромосомних гена РДНК; цю ділянку здійснював аутосплайсінг, тобто сам вирізав себе при дозріванні рРНК 2. Важливість амілолітичних ферментів В останні роки розширюються можливості використання крохмальдеградуючих ферментів. Зокрема амілаз, що на сам перед привертають увагу дослідників завдяки їх технологічній важливості і економічній вигідності. Вони характеризуються широким спектром застосування в різних галузях, таких як клінічна, фармацевтична, медична і аналітична хімія, у цукрофікації крохмалю та інших галузях промисловості. Амілази становлять близько 30% світової продукції ферментів. На сьогоднішній день амілолітичні ферментні препарати мають широкий спектр застосування в різних галузях промисловості. Великий відсоток застосування ферментів припадає на харчову промисловість, наприклад на виробництво спирту як каталізатора процесу розрідження і оцукрювання сировини. Також ферменти застосовуються в технічний цілях, хімічної промисловості, фармацевтичних цілях, а також у якості діагностичних препаратів Амілолітичні ферменти каталізують гідроліз високомолекулярних полісахаридів крохмалю і глікогену. Найважливішим джерелом амілаз є злакові, які містять їх як у не пророщеному, так і в пророщеному зерні. В останньому випадку амілази проявляють високу активність. Широко застосовуються амілази у крохмале-патоковому, спиртовому, пивоварному і хлібопекарському виробництвах як головні ферменти, що каталізують процеси розщеплення крохмалю і утворення цукрів, що можуть зброджуватися. То постає питання про оптимізацію методу визначення активності ферментів. Амілолітичну активність характеризує здатність ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються йодом. 3. Властивості та структура амілолітичних ферментів Принципова структура ферменту наступна: кожен фермент складається з апофермента і коферменту, які, кожен окремо, не активний, але виявляють свою дію в комплексі - холоферменті. Всі ферменти мають білкову природу. Вони являють собою або прості білки, цілком побудовані з поліпептидних ланцюгів і розпадаються при гідролізі тільки на амінокислоти (наприклад, гідролітичні ферменти трипсин і пепсин, уреаза), або - в більшості випадків - складні білки, що містять разом з білкової частиною (апоферментом) небілкової компонент (кофермент або простетичної групу). Багато ферменти з великою молекулярною масою проявляють каталітичну активність тільки у присутності специфічних низькомолекулярних речовин, які називаються коферментом (або кофактором). Роль коферментів грають більшість вітамінів і багато мінеральних речовин. Вітаміни РР (нікотинова кислота, або ніацин) і рибофлавін, наприклад, входять до складу коферментів, необхідних для функціонування дегідрогеназ. Цинк - кофермент карбоангідрази, ферменту, який каталізує вивільнення з крові діоксиду вуглецю, який видаляється з організму разом з повітрям, що видихається. Залізо і мідь служать компонентами дихального ферменту цитохромоксидази. Речовини, яка піддається перетворенню в присутності ферменту, називають субстратом. Субстрат приєднується до ферменту, який прискорює розрив одних хімічних зв'язків в його молекулі та створення інших; що утворюється в результаті продукт від'єднується від ферменту. Продукт теж можна вважати субстратом, оскільки всі ферментативні реакції в тій чи іншій мірі оборотні. За типом реакцій, що каталізуються ферменти підрозділяються на 6 класів згідно ієрархічної класифікації ферментів (КФ, EC - Enzyme Comission code). Кожен клас містить підкласи, так що фермент описується сукупністю чотирьох чисел, розділених крапками. Перше число грубо описує механізм реакції, що каталізується ферментом: КФ 1: оксидоредуктаиз, каталізують окислення або відновлення. КФ 2: трансферази, каталізують перенос хімічних груп з однієї молекули субстрату на іншу. КФ 3: Гідролази, каталізують гідроліз хімічних зв'язків. Приклад: естерази, пепсин, трипсин, амілаза, ліпопротеінліпаза КФ 4: Ліази, каталізують розрив хімічних зв'язків без гідролізу з утворенням подвійного зв'язку в одному з продуктів. КФ 5: Ізомерази, каталізують структурні або геометричні зміни в молекулі субстрату. КФ 6: Лігази, каталізують утворення хімічних зв'язків між субстратами за рахунок гідролізу АТФ. Будучи каталізаторами, ферменти прискорюють як пряму, так і зворотну реакції, тому, наприклад, ліази здатні каталізувати і зворотну реакцію - приєднання по подвійним зв'язкам. Ферменти являють собою біокаталізатори білкової природи. Каталізуючи переважна більшість біохімічних реакцій в організмі, ферменти регулюють обмін речовин і енергії, граючи тим самим важливу роль у всіх процесах життєдіяльності. Всі функціональні прояви живих організмів (дихання, м'язова скорочення, передача нервового імпульсу, розмноження і т.д.) забезпечуються дією ферментних систем. Сукупністю ферментних реакцій, що каталізуються, є синтез, розпад та інші перетворення білків, жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот, гормонів та інших сполук. Активність ферментів визначається їх тривимірної структурою. Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, яка згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і виходить молекула (білкова глобула) має унікальні властивості. Кілька білкових ланцюгів можуть об'єднуватися в білковий комплекс. Третинна структура білків руйнується при нагріванні або дії деяких хімічних речовин. Щоб каталізувати реакцію, фермент повинен зв'язатися з одним або декількома субстратами. Білковий ланцюг ферменту згортається таким чином, що на поверхні глобули утворюється щілина, або западина, де зв'язуються субстрати. Ця область називається сайтом зв'язування субстрату. Зазвичай він збігається з активним центром ферменту або знаходиться поблизу нього. Деякі ферменти містять також сайти зв'язування кофакторів або іонів металів. Фермент, з'єднуючись з субстратом: • очищає субстрат від водяної «шуби» • має у своєму розпорядженні реагують молекули субстратів в просторі за потрібне для протікання реакції чином • готує до реакції (наприклад, поляризує) молекули субстратів. Зазвичай приєднання ферменту до субстрату відбувається за рахунок іонних або водневих зв'язків, рідше - за рахунок ковалентних. Наприкінці реакції її продукт (або продукти) відділяються від ферменту. У результаті фермент знижує енергію активації реакції. Це відбувається тому, що в присутності ферменту реакція йде іншим шляхом (фактично відбувається інша реакція), наприклад: У відсутності ферменту: А + В = АВ У присутності ферменту: А + Ф = АФ АФ + В = АВФ АВФ = АВ + Ф де А, В - субстрати, АВ - продукт реакції, Ф - фермент. Ферменти не можуть самостійно забезпечувати енергією ендергонічні реакції (для протікання яких потрібна енергія). Тому ферменти, що здійснюють такі реакції, сполучати їх з екзергонічними реакціями, що йдуть з виділенням більшої кількості енергії. 4. Класифікація амілаз За субстратної специфічності амілази класифікують на альфа-, бета-і гамма-амілазу. α-Амілаза α-Амілаза (КФ 3.2.1.1; 1,4-α-D-глюкан-глюканогідролаза; глікогеназа) є кальцій-залежним ферментом. До цього типу відносяться амілаза слинних залоз і амілаза підшлункової залози. Вона здатна гідролізувати полісахарідную ланцюг крохмалю та інших довголанцюгових вуглеводів в будь-якому місці. Таким чином, процес гідролізу прискорюється і призводить до утворення олігосахаридів різної довжини. У тварин α-амілаза є основним травним ферментом. Активність α-амілази оптимальна при нейтральній pH 6,7-7,0. Фермент виявлений також у рослин (наприклад, у вівсі), в грибах (в аскоміцетів і базидіоміцетів) і бактеріях (Bacillus). β-Амілаза β-Амілаза (КФ 3.2.1.2; 1,4-α-D-глюкан-мальтогідролаза) присутній у бактерій, грибів і рослин, але відсутня у тварин. Вона відщеплює другу з кінця α-1 ,4-Глікозидний зв'язок, утворюючи, таким чином, дисахарид мальтозу. При дозріванні фруктів β-амілаза розщеплює плодовий крохмаль на цукор, що призводить до солодкого смаку стиглих плодів. У насінні β-амілаза активна на стадії, що передує проростання, тоді як α-амілаза важлива при безпосередньо проростання насіння. β-Амілаза пшениці є ключовим компонентом при утворенні солоду. Бактеріальна β-амілаза бере участь в розкладанні позаклітинного крохмалю. γ-Амілаза γ-Амілаза (КФ 3.2.1.3; глюкан-1 ,4-α-глюкозидази; амілоглюкозідаза; екзо-1 ,4-α-глюкозадаза; глюкоамілаза; лізосомальних α-глюкозидази; 1,4-α-D-ГЛІКАНА-глюкогідролаза) відщеплює останню α-1 ,4-Глікозидний зв'язок, приводячи до утворення глюкози. Крім цього, γ-амілаза здатна гідролізувати α-1 ,6-Глікозидний зв'язок. На відміну від інших амілаз γ-амілаза найбільш активна в кислих умовах при pH 3. 5. Механізм дії амілолітичних ферментів Субстратами для дії амілаз є крохмаль, щоскладається з амілози і амілопектину, і глікоген. Крохмаль – рослинній полісахарид з дуже складною будовою. Містить 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю. При вивченні механізму дії амілолітичних ферментів є певні складності, і перш за все вони полягають у тому, що субстрат - крохмаль - неоднорідний і має різні характеристики за ступенем полімеризації глікозидного ланцюга і кількості розгалужень. Реакції, що каталізується амілазами, мають дві стадії: коротку передстаціонарну і тривалу стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи. Тому кінцеві продукти гідролізу а-амілазами можуть бути різними. Перша стадія впливу ферменту на субстрат хоча і носить неупорядкований характер, має для всіх видів амілаз схожий механізм. Існує дві гіпотези про механізм дії екзоамілаз на субстрат. Перша гіпотеза припускає, що, впливаючи на субстрат по одноланцюжкові або «молніеобразному» механізму, екзоамілаза утворює фермент-субстратний комплекс із захопленням нередукуючого кінця ланцюга. Подальше просування ферменту з цього ланцюга відбувається до повного її гідролізу. За другою гіпотезою (б- і глюкоамілаза діють на субстрат шляхом механізму множинної атаки, тобто фермент утворює комплекс з молекулою субстрату, потім через кілька етапів цей комплекс розпадається і фермент зв'язується з новою молекулою субстрату. Іншими словами, при множинної атаці відбувається щось середнє між неврегульованим механізмом і одноланцюжкові, «молніеобразной» атакою. Для повного гідролізу з цього механізму одна молекула субстрату повинна утворювати багато разів фермент-субстратні комплекси. При цьому можливий гідроліз декількох зв'язків в одному каталітичному акті. | |
| Просмотров: 540 | Загрузок: 8 | Рейтинг: 0.0/0 | |
| Всего комментариев: 0 | |